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高效液相色譜柱的選擇

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現在高效液相色譜中,分離效果好壞的一個重要指針是色譜填料的選擇,但是目前市場上有多種色譜填料可供選擇,因此就必須對此有一定的認識和了解。

一、硅膠基質填料
1、正相色譜 正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其它具有極性官能團,如胺基和氰基的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基或其它極性基團極性較強,因此, 分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小,即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,如正己烷,氯仿,二氯甲烷等。
2、 反向色譜 反向色譜用的填料常是以硅膠為基質,表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強,通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。 樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出,而極性較弱的組分在色譜柱上有更強的保留。常用的反向填料有C18、C8、C4等。
二、聚 合物填料 聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,其重要優點是在PH值為1-14均可使用。相對于硅膠基質的C18填料,這類填料具有更強的疏水 性;大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。現有的聚合特填料的缺點是相對硅膠基質填料,色譜柱柱效較低。
三、其它無機填料 其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化,由于其特殊的性質,一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠 基質烷基鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎,不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分 離某些幾何異構體,由于在HPLC流動相中不會被溶解,這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強,可制成穩定的色譜 柱柱床,其優點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強,應用范圍受到一定限制,所以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基 質填料也可用于HPLC。商品化的只有聚全物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,應用PH1-14,溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是最近幾年才開始研究,加 之面臨的實驗難度,其重要用途與優勢尚在進行之中。
目前,商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售,而目前分析分離主要用3和5um 填料。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數,即柱效和背壓。粒度越小,柱壓越大,柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下,提高柱 效可提高分離度,但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選擇用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下 的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱,即相同的塔 板數或分離能力,但是柱長更短,以縮短分析時間。另外,可以彩用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。

色譜技術

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